2010年9月24-26日，环渤海第一届曁天津市第十九届色谱学术报告会-仪器展览会在风景秀美的天津市蓟县黄崖关长城脚下隆重开幕。大会期间，来自环渤海地区的色谱专家做大会报告，介绍了色谱质谱技术及其应用等内容。下面对专家的精彩报告予以报道。

蛋白质样品预处理方法进展

 

中国科学院大连化学物理研究所国家色谱研究分析中心 张玉奎 院士

　　中国科学院大连化学物理研究所国家色谱研究分析中心张玉奎院士作了题为《蛋白质样品预处理方法进展》的报告，主要介绍了通用性富集、选择性富集选择性富集和膜蛋白预处理等三种蛋白质样品预处理方法。

　　通用性富集方法一般包括蛋白质均衡技术和介孔杂化C8磁性纳米颗粒技术。基于六肽库的蛋白质均衡技术可显著降低蛋白质的动态分布范围，但蛋白质与配基库结合的特异性有限，易造成假阳性或假阴性结果。而基于单链可变区片段（scFv）文库为配基的蛋白质均衡器有三个优点：1）106种scFv片段，每种 106个；2）单链可变区片段（scFv）与蛋白质结合的特异性和强度都比六肽强；3）固载的文库可通过感染病毒进行复制扩增。另外还有亲水基质蛋白质均衡器，和以两性电解质作为配体、磁性纳米材料为基质的新型均衡器等。接着，张院士举了一个人血清中蛋白质鉴定的例子。结果显示：与原始样品相比，每个馏分都都能鉴定到更多数量的蛋白质；样品经蛋白质均衡器处理后，白蛋白丰度显著降低；蛋白质鉴定数目提高了3~4倍。

　　选择性富集方法包括蛋白质印迹材料、杂化固载金属亲和色谱(IMAC)整体材料和金属氧化物气溶胶等三方面内容。分子印迹法是指以球形大孔硅胶为基质，将模板蛋白——猪血清白蛋白（PSA）与甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸为功能单体，甲叉双丙烯酰胺为交联剂的聚合物溶液先后抽入硅胶孔道内，自由基引发进行聚合反应。反应结束后，用 NH4HF2刻蚀硅胶后，将聚合物洗用纯水至中性，晾干，得到外形与硅胶形状互补的印迹微球。杂化整体IMAC 材料对α-酪蛋白酶解产物（磷酸化肽）具有很好的选择性，而且载样量可达2.6mg/mL，回收率为68.9%。

　　膜蛋白质在外界物质识别、运输以及信号传到等方面具有重要作用。据估计，药物靶点中，大约有2/3为膜蛋白质。基于离子液体的膜蛋白质样品预处理技术所选用的离子液体是1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（BMIM BF4），这是一种常用的离子液体，极性和甲醇相近（甲醇：77；BMIM BF4：67），结构和表面活性剂相近（亲水+疏水基团），易于去除（C18捕集性）。现有膜蛋白质处理技术中 BMIM BF4方法可以鉴定到更多的跨膜蛋白质，与Urea及Rapigest方法比，可以分别提高80%与25%，与SDS和Methanol方法比，可以提高 3倍以上。鉴定的跨膜蛋白质比较：BMIM BF4方法鉴定所得跨膜蛋白质分别包含SDS、Methanol、Urea和Rapigest方法所鉴定跨膜蛋白质85%、74%、74%、71%。

 

高分辨色谱与质谱技术在持久性有机污染物分析中的应用

中国科学院生态环境研究中心环境化学与生态毒理学国家重点实验室 江桂斌 院士

　　中国科学院生态环境研究中心环境化学与生态毒理学国家重点实验室江桂斌院士作了题为《高分辨色谱与质谱技术在持久性有机污染物分析中的应用》，主要介绍了持久性有机污染物（POPs）的特点和种类、高分辨色谱质谱技术在环境监测中的应用、新型污染物的筛选及识别技术及未来研究所面临的各种挑战等四方面内容。

　　化学污染物在很长时间内是环境污染的主体，包括难挥发的重金属、离子化合物、表面活性剂和高聚物等，易挥发的室内、空气污染物等，以及半挥发的持久性有机 污染物。在整个有机污染物中，POPs虽然只占2%的比例，但由于它难降解、长距离迁移、在生物体内含量增大、毒性大等特点，对环境和人类产生较大的危害。大部分新POPs 物质不仅可以在环境中长期存在,而且可以通过大气、水体或其它途径传播到各个区域。同时,由于这些污染物均具有较强的亲脂性,容易在食物 链中逐级放大,产生强烈的累积效应。除此之外, 这些新POPs 物质具有类似的毒性终点, 不仅具有致癌、致畸、致突变性，而且还具有内分泌干扰作用。目前，联合国UNEP 已将五溴联苯醚、八溴联苯醚、PFCs 等化学品列入《斯德哥尔摩公约》受控名单。

　　POPs的结构复杂、含量低、毒性差别大，目前一般采用高分辨色谱和质谱技术进行这方面的研究。如二恶英有２１０种、多氯联苯２０９种、多溴联苯醚２０９中，而且含量在ｐｐｔ或ｐｐｂ级，因此，测定POPs 是环境分析化学最复杂和最困难的工作。目前江院士已掌握了１２种经典POPs的分析，而毒杀芬种类繁多，具有立体结构，其分析仍是现代有机分析的难题。现 在我们已发展了同时测定Ｄｉｏｘｉｎｓ、ＰＣＢｓ和ＰＢＤＥｓ的方法体系，建立了各种介质中ＰＦＣｓ的高灵敏度分析方法、ＳＣＣＰ的分析方法等。

　　江院士在新型污染物的筛选及识别技术方面开展了一些工作，通过下述三种不同的技术途径筛选到一些新的污染物并开展了有关毒理学的前期研究：1）基于化合物定 量结构-物化性质相关模型(QSPRs) 对环境中新型PBT物质的鉴别。2）基于质量平衡关系筛选和鉴别新型污染物。3）生物效应引导的新型污染物识别方法。通过将多维化学分析与毒性测定仪器相 结合，研制出用于EDA 的成组毒理学分析仪（Integrated Toxicology Analyzer），并建立了以发育神经毒性为检测终点，环境样品中溴代阻燃剂等复合有机污染物的毒性筛选及识别方法。

　　我国对于新POPs 问题准备十分不足，基础工作相当薄弱，缺乏标准的分离测定和分析方法及其质量保证体系。由于新型污染物通常浓度较低、组分复杂， 而且干扰物质较多，因此，对分析技术有更高的要求，发展高灵敏度和高选择性的分离分析方法是解决问题的主要出路。在对POPs的研究中，主要面临环境中存在的难电离物质分析、基质干扰、甲基等不稳定代谢产物的检测、高分离色谱与高分辨质谱的结合、同位素质谱为环境分析等五方面挑战。

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在线正/反相二维液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用用于大鼠腹膜表层的磷脂轮廓分析

北京大学化学与分子工程学院 刘虎威 教授

　　北京大学化学与分子工程学院刘虎威教授作了题为《在线正/反相二维液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用用于大鼠腹膜表层的磷脂轮廓分析》的报告，主要介绍了磷脂类化合物的结构、特点和分类，以及磷脂类化合物的分析分离方法，并以大鼠实验为例，讲解了在线正/反相二维液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用用于大鼠腹膜表层的磷脂的分离分析和分子鉴定。

　　磷脂是生物体内一类重要的物质，他们是生物膜的主要组成部分，参与脂类化合物的体内代谢过程和信号传导过程；生物体内或细胞膜磷脂成分的改变与生物体的生理病理状态密切相关（与磷脂有关的疾病，如动脉粥样硬化、糖尿病、肥胖症、帕金森综合症等）。因此，准确分析生物体内磷脂成分能够为临床诊断与疾病监测提供依据。

　　磷脂类化合物主要由多元醇骨架、极性头部和疏水尾部三部分组成，根据多元醇骨架的不同可以分为甘油磷脂和鞘磷脂两大类。甘油磷脂是以甘油作为磷脂骨架，它的甘油骨架C1和C2位被脂肪酸酯化，形成长链脂肪酸的疏水尾部。C3位被磷酸酯化，同时磷酸会进一步被另一极性醇酯化，形成磷脂的极性头部。根据极性头部的不同甘油磷脂可以分为不同的类别，如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸等等。鞘磷脂以鞘氨醇为骨架，由鞘氨醇、脂肪酸和磷酰胆碱（少数是磷酰乙醇胺）组成。

　　在目前分离分析磷脂类化合物的方法中以液相色谱质谱联用技术的灵敏度最高，抗干扰能力最好，同时通过多级质谱技术能够对磷脂分子进行鉴定。而分离分析磷脂类化合物的两种液相色谱方法-正相液相色谱（NPLC）和反相液相色谱（RPLC）的单独使用都无法达到最佳的分离效果，NPLC方法是针对极性头部不同分离脂不不同类别，RPLC方法是针对脂肪酸链的不同分离脂的不同分子种属。因此，采用将NPLC和RPLC偶联的二维液相色谱方法，是可以得到更好的分离效果，更多的磷脂分子信息。

　　刘教授采用在线正/反相二维液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用方法，对鼠腹膜表层的磷脂轮廓进行了分离分析，并且对检出的磷脂组分进行了结构鉴定和碎裂机制研究。研究成果将对临床诊断与疾病监测起到强有力的指导作用。

 

聚合物整体柱在体内药物分析及蛋白分离的应用

河北大学药学院 杨更亮教授

　　河北大学药学院杨更亮教授作了题为《聚合物整体柱在体内药物分析及蛋白分离的应用》的报告，主要介绍了聚合物整体柱的制备及其在分离蛋白等方面的应用。

　　近年来，高效液相色谱方法（HPLC）在分离分析领域中扮演着越来越重要的角色。而其中，色谱柱是整个色谱系统的核心，聚合物整体柱的开发和应用弥补了传统的填充柱的诸多缺点。目前所报道的聚合物整体柱虽然对蛋白质叶具有较好的分离能力，但是聚合物的结构难以控制均匀，且聚合完成后需要进行进一步的修饰，步骤繁琐，耗时耗力。

　　杨教授给出了一种新型有机无机复合聚合物整体柱的制备方法，该制备过程利用原子转移自由基聚合（ATRP）机理进行聚合，可以通过改变单体、引发剂以及催化剂的比例来控制自由基的活性，从而获得结构均匀的聚合物。典型的制备方案为：功能单体GMA（1.1mL）、交联剂EDMA（0.6mL）、良溶剂环己醇（3.4mL）、不良溶剂正十二醇（0.4g）和引发剂AIBN（30mg）的混合液超声10分钟，再通氮气15分钟除氧后，加入密封两端的不锈钢柱管中，55℃恒温反应24h。将色谱柱接入高效液相色谱系统，先用THF而后用甲醇冲去柱内的致孔剂、反应未尽的单体以及其它可溶性产物，即得到聚合物整体柱。

　　杨教授用制备的聚合物整体柱对蛋白质进行分离纯化，分别考察了缓冲盐的种类、浓度和pH值对蛋白在整体柱上保留行为的影响。随后，改变流速来考察分离蛋白的情况，发现当流速为6ml/min时，四个标准蛋白在一分钟内得到了良好的分离，说明蛋白的分离不受流速的影响，也说明该整体柱具有良好的通透性能。同时，杨老师用该柱进行了牛奶中三聚氰胺的检测实验，以及整体柱离子特性和疏水特性的实验。另外，利用金属-有机络合凝胶（MOC）模板法制备3D网络骨架的P（GMA-EDMA）整体柱仍有尚待解决的问题：1）骨架和孔径尺寸的均一性还不够好；2）金属离子会有残留，部分环氧基团水解，不利于进一步修饰。

　　该聚合物整体柱的制备利用了原子转移自由基（ATRP）的原理，并采用引发剂AIBN引发聚合，改善了传统的原位自由基聚合的链转移链终止所导致的分子量分布范围宽、聚合物不均匀等缺点，改善了聚合物整体柱的颗粒堆积致孔，得到了具有较为均匀的骨架结构的聚合物整体柱，且无需经过化学修饰即可对蛋白进行快速高效的分离分析。

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基于液相色谱质谱技术鉴定蛋白质翻译后修饰的研究进展

南开大学化学学院 张锴 教授

　　南开大学化学学院张锴教授作了题为《基于液相色谱质谱技术鉴定蛋白质翻译后修饰的研究进展》的报告，主要介绍了蛋白质翻译后修饰的富集技术，蛋白质修饰在生理过程中的动态变化检测和定量分析，蛋白质修饰的在细胞中的相互作用和网络关系，未知性蛋白修饰的鉴定策略，以及LC/MS/MS鉴定组蛋白翻译后修饰等内容。

　　蛋白质翻译后修饰包括磷酸化、泛素化、乙酰化和甲基化，具有蛋白质翻译后修饰丰度低、蛋白质修饰在生理过程中的动态变化、蛋白质修饰的种类多样性和未知的蛋白质修饰等特点。这些修饰是表观遗传学的重要内容，对染色体的结构和功能有重要的影响。目前通过特异性抗体或质谱技术等方法已经发现了组蛋白上几十种不同的修饰。但是，发生在组蛋白的翻译后修饰数量预计远超过已鉴定出的数量，应该还有更多的修饰没有发现。大量的修饰具有潜在的功能响应。基于质谱技术的蛋白质组学方法是鉴定翻译后修饰位点的有力工具，然而，它的瓶颈在于很难从复杂样品中鉴定未知的修饰。

 

农兽药残留检测中LC-MS/MS方法优化策略

山东出入境检验检疫局 牛增元 研究员

　　山东出入境检验检疫局牛增元研究员作了题为《农兽药残留检测中LC-MS/MS方法优化策略》的报告，牛研究员以食品农产品中敏感检测项目，如硝基呋喃代谢物、Bata-兴奋剂（瘦肉精）、氟苯尼考胺、涕灭威等农兽药残留为例，介绍在液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测方法建立中，色谱分离条件以及串联质谱条件的选择优化策略。

　　影响质谱定量的主要因素

　　（1）色谱峰采集点数。为更好的定量，色谱峰采集点数至少要采集15-20个点，如果采集的点不够，得到的峰不完全，损失信息。

　　（2）喷雾稳定性。喷雾稳定性会影响信号的强度，喷雾不好会影响峰行，且标准曲线不好，使精密度下降。

　　（3）峰形。峰形不好，积分会有偏差，导致定量不准确。

　　（4）色谱。色谱好可以带来更好的定量和校准曲线，同时色谱能将峰分离开，使S/N和RSD更好。

　　（5）添加剂。质谱中使用的添加剂只能是挥发性溶剂，不挥发的缓冲溶液、酸和碱使灵敏度降低、出峰不稳定，影响定量。

　　（6）内标。内标的使用可提高数据的重复性和精确度，内标物可选择稳定同位素。

　　（7）质量分辨能力。高的质量分辨能力能把质量相近的化合物分开，提高质谱的定量能力。

　　色谱和质谱条件建立过程

　　根据化合物的性质（分子量、结构极性等）来确定仪器条件（离子源类型、正负离子话模式、裂解方式等），仪器确定好后，优化质谱条件和色谱条件，质谱条件主要是优化母离子、子离子和碰撞能量等参数，色谱条件主要是优化色谱柱、流动相、梯度/等度，流速等条件。条件确定好后要对标准溶液及基质匹配标准溶液进行考察，考察项目包括重复性、重现性、各离子的信噪比、基质效应和线性范围等。

　　色谱质谱方法优化实例

　　通过姜中涕灭威残留测定、调味酱中硝基呋喃代谢物残留测定和稻米中苯氧羧酸除草剂残留测定的例子介绍了定量离子和定性离子的选择。通过动物源性食品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林残留量检测介绍了色谱质谱方法建立的过程，包括流动相的选择、在复杂基质中如何选择子离子、考虑到基质的抑制作用选择内标法定量等。

 

液质联用技术在天然产物及中药分析中的应用

南开大学 白钢 教授

　　南开大学白钢教授作了题为《液质联用技术在天然产物及中药分析中的应用》的报告，介绍了LC-MS/MS技术在中药和天然产物成分分析中的应用。

　　白教授讲到，中药及天然产物成分复杂，并且其活性成分及其代谢物在生物样品中的浓度较低，生物样品的内源性杂质较多等对分析技术提出了很高的要求。日趋成熟的LC-MS-MS技术具有灵敏度高、特异性强及操作简便的优势，再加上HPLC与DAD检测器联用、HPLC与NMR联用等联用技术的补充，将在中药和天然产物的定量分析、靶药物成分的筛选及药物代谢物的鉴定等领域发挥不可替代的作用。白教授利用LC-MS/MS技术对多种中药和天然产物进行分析，确认了多种有效成分及靶药物成分。