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有关血清脂蛋白的离心分离技术介绍

作者：未知 2009-11-02 点击973

        利用不同容量的角式转头及很容易配制的梯度液，在各种型号的超速离心机上都能得到满意的分离结果。下面举了几个分离实例，实际上还可以应用于各种型号各种容量的固定角式转头。

（一）   梯度液
A液：11.40gNacl，0.1g EDTA-Na2，置于1000ml量筒中加入500ml重蒸水及1
ml 1N NaOH，混匀至全部溶解。加重蒸水至1000ml最后再加3ml重蒸水（Nacl：0.195mol）。终密度1.006g/cm3，PH10.37。
B液：加24.98g NaBr 到100ml A液中。终密度1.182g/cm3。（Nacl：0.195mol， NaBr：7.65mol），PH9.72。
C液：加78.32g NaBr 到100ml A液中。终密度1.478g/cm3。（Nacl：0.195mol， NaBr：7.65mol），PH8.86。
（二）   离心机及转头
• 离心机：Hitachi CP-MX系列超速离心机或其他类似机组。
Hitachi CS-150GXL微量超速离心机。
• 转头，离心管；S 140 AT：140,000rpm,1,050,000×g，10×2ml，K=5，1PC厚壁管。
S 80 AT3：80,000rpm,415,000×g，8×8ml，K=23，6PC厚壁管。
S 70 AT：70,000rpm,505,000×g，8×40ml，K=44，40PA管。
（三）   血浆-血球分离：
全血，角转头或甩平转头3000rpm×20min，沉淀为血细胞，上清血浆待用。
（四）   乳糜粒分离：
      • 离心参数：各种转头均可用，4×106（g×min），10℃
• 梯度液：离心管下部3/4容积为血浆，上部1/4容积为0.15MNacl+0.3MEDTA。PH7.4。
• 离心结果：乳糜粒上浮，离心管倾斜，吸管贴管壁慢吸出（约占血浆容积的2~6%。禁令12小时以上供血者血浆中乳糜含量很低，食后供血者含量较高。
（五）   血清脂蛋白分离：

转头
离心管内液体分布
离心参数
结果
S140AT
(CS-150GXL机组)
下部600μl血浆
上部300μl A液
140，000rpm×50min
16℃
加速：5
减速：7
可见明显分层上部约1/3VLDL吸出
S80AT3
(CS-150GXL机组)
下部3.4ml血浆
上部1.7mlA液
80，000rpm×4.5hrs
16℃
加速：5
减速：7
同上
P70AT
(CP-MX机组)
下部24ml血浆
上部11.7ml A液
70，000rpm×8hrs
16℃
加速：5
减速：7
同上

（ⅰ）VLDL分离（ρ<1.006g/cm3）
 
（ⅱ）LDL（含IDL）分离（1.006g/cm3<ρ<1.063g/cm3）
 

转头
离心管内液体分布
离心参数
结果
S140AT
(CS-150GXL机组)
第一次离心后上部VLDL取出，下部600μl移入另一离心管，加入300μl B液，充分混合
140，000rpm×80min
16℃
加速：9 减速：7
上部1/3体积LDL+IDL吸出
S80AT3
(CS-150GXL)
第一次离心后上部VLDL吸出，，下部3.4ml移入另一离心管，加入1.7ml B液并充分混合
80，000rpm×5.5hrs
16℃
加速：9减速：7
同上
P70AT
(CP-MX系列超速机或类似机型)
第一次离心后上部11.7ml吸出，下部约24ml 移入另一离心管，加入11.7ml B液，充分混合
70，000rpm×10hrs
16℃
加速：9 减速：6
同上

 
（ⅲ）HDL分离（1.063g/cm3<ρ<1.21g/cm3）
 

转头
离心管内液体分布
离心参数
结果
S140AT
(CS-150GXL机组)
第二次离心后吸出上部300μl后，下部600μl移入另一离心管，加入300μl C液，充分混合
140，000rpm×140min
16℃
加速：9
减速：7
可见较明显分层，
上部为HDL，下部为血清白蛋白及球蛋白
S80AT3
(CS-150GXL机组)
第二次离心后吸出上部约1.7ml、下部3.4ml移入另一离心管，加入1.7ml C液，充分混合
80，000rpm×8小时
16℃
加速：9
减速：7
同上
P70AT
(CP-MX系列机或其他类型机组)
第二次离心后吸出上部1/3、下部2/3移入另一离心管，加入约12ml C液，充分混合
70，000rpm×15小时
16℃
加速：9
减速：6
同上

（本文部分实验由上海长海医院 贾凤玉完成）
参考文献
（1）       余兴明：“血清脂蛋白的离心分离技术”，“生命的化学”，1997.3
（2）       Hitachi KoKi：“himac Application’,No:89,1999.7 No：103，2000.10
 
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