资料介绍
最近，一则关于“果冻，老酸奶是由破皮鞋做成的”消息在网上疯传，因破皮鞋可以提炼出明胶。经调查发现，不仅老酸奶，多种果粒酸奶、谷物酸奶，甚至普通酸牛奶中，几乎都含有中含有明胶、琼脂、卡拉胶、果胶等食品增稠剂。明胶的品质主要取决于原料。通常来说，合格的明胶是从动物鲜皮、骨料内提胶，经6道提胶工序后，对提取的明胶进行蒸发、干燥，最后根据多项控制指标进行混合形成成品。但为了降低成本，获得更多利润，国内很多厂家用皮革厂经过鞣铬加工后的蓝矾皮的皮革屑，边角料、烂皮革等作为生产原料。皮革制成的明胶透明，无味，消费者根本无法将正规的食用明胶和皮革制成的明胶区分开来。
皮革水解蛋白是皮革废料或动物皮毛、脏器等水解生成的一种蛋白粉，对于乳与乳制品中皮革水解蛋白的鉴定，主要是通过对L-羟脯氨酸含量的测定。L-羟脯氨酸是胶原蛋白(皮革水解蛋白)特有的氨基酸，在乳酷蛋白中则没有，所以一旦检出，则可认为可能含有皮革水解蛋白，即可判断该乳制品中有可能含有由废弃皮革而来的成分。
赛智科技应用质检部采用L-羟脯氨酸衍生方法，利用公司自己的LC-10Tvp高效液相色谱仪，对L-羟脯氨酸进行了分析检测试验，并通过公司的VI2010色谱工作站进行了详细分析，得出的检测结果准确，可靠，供广大客户参考使用。
以下是L-羟脯氨酸的测定的详细检测方法：
L-羟脯氨酸的高效液相色谱仪(HPLC)测定
1 仪器与试剂
1.1 仪器、器皿
1.1.1 LC-10Tvp高效液相色谱仪
1.1.2 Vertex 色谱柱 250mm×4.6mm×5μm
1.1.3 11 mL水解瓶
1.1.4 1.5 mL塑料离心管
1.1.5 20 mL玻璃具塞刻度试管
1.1.6 5 mL玻璃具塞刻度试管
1.1.7 0.22 μm针头式过滤器
1.1.8 2 mL样品瓶
1.2 试剂
1.2.1 甲醇（色谱纯）
1.2.2 乙腈（色谱纯）
1.2.3 正己烷（色谱纯）
1.2.3 三乙胺（色谱纯）
1.2.4 冰醋酸（色谱纯）
1.2.5 磷酸氢二钠（无水色谱纯）
1.2.6 磷酸二氢钠（无水色谱纯）
1.2.7 L-羟脯氨酸标准品
1.2.8 蛋白水解试剂：称取0.1 g苯酚置于100 mL容量瓶，加入50 mL浓盐酸(36%-38%，摩尔浓度约为12 mol/L)，然后加水定容至100 mL。
1.2.9 0.1 mol/L HCl水溶液：量取8.3 mL浓盐酸，然后用纯水定容至1000 mL。
1.2.10 衍生剂PITC溶液：将250 μL异硫氰酸苯酯(PITC)用乙腈定容至10 mL。
1.2.11 三乙胺溶液：将1.4 mL三乙胺用乙腈定容至10 mL。
1.2.12 衍生剂DNFB溶液：0.5 mL 2,4-二硝基氟苯(DNFB)溶于50 mL乙腈。
1.2.13 Na2B4O7缓冲溶液：称取1.91 g Na2B4O7•10H2O，用50 mL纯水溶解。
1.2.14 氨基酸储备液：称取一定量L-羟脯氨酸，用0.1 mol/L HCl水溶液溶解，得到浓度为 0.05 mol/L的储备溶液。
1.2.15 氨基酸使用液：将储备液用0.1 mol/L HCl水溶液稀释，得到浓度为0.0003 mol/L的L-羟脯氨酸溶液。
1.2.16 磷酸盐缓冲溶液：0.02 mol/L Na2HPO4 和NaH2PO4水溶液。
2 实验方法
2.1 样品水解
(1) 称取奶粉0.1 g或牛奶0.68 g置于蛋白水解瓶中(1.1.3)，加入蛋白水解试剂(1.2.8)，旋紧盖子，振荡混匀，110 °C下反应24 h。
(2) 反应完毕，将反应液全部转移至100 mL蒸馏瓶中，75℃下减压蒸馏至近干。
(3) 用12 mL0.1 mol/L HCl水溶液(1.2.9)分三次溶解残渣，并转移到20 mL玻璃具塞刻度试管(1.1.5)，再用纯水定容至20 mL，待衍生。
2.2 样品衍生
2.2.1 异硫氰酸苯酯(PITC)衍生方法
(1)样品水解溶液衍生
量取200 μL样品水解溶液，置于1.5 mL塑料离心管中，加入100 μL三乙胺溶液(1.2.11)和100 μL衍生剂PITC溶液(1.2.10)，混匀，室温反应1h，加入400μL正己烷(1.2.3)，旋紧盖子后剧烈振荡5~10 s，静置分层，取200 μL下层溶液与800 μL水混合，经0.22 μm针式过滤器(1.1.7)过滤，待分析。
(2) 标准溶液衍生化
量取200 μL L-羟脯氨酸使用液*(1.2.15)，置于1.5 mL塑料离心管中，加入100 μL三乙胺溶液(1.2.11)和100 μL衍生剂PITC溶液(1.2.10)，混匀，室温反应1h，加入正己烷400 μL(1.2.3)，旋紧盖子后剧烈振荡5~10 s，静置分层，取200 μL下层溶液与800 μL水混合，经0.22 μm针式过滤器(1.1.7)过滤，待分析。
*根据实际情况，氨基酸使用液浓度可进行调整，本方法中氨基酸使用液浓度仅供参考。
2.2.2 2,4-二硝基氟苯(DNFB)衍生方法
(1) 样品溶液衍生
取0.5 mL样品水解溶液置于5 mL玻璃具塞刻度试管(1.1.6)中，加入0.5 mL Na2B4O7缓冲溶液(1.2.13)和0.5 mL衍生剂DNFB溶液(1.2.12)，具塞摇匀，于60 °C下避光反应1 h。反应完毕将试管置于冷水中冷却，用磷酸盐缓冲溶液(1.2.16)定容至5 mL，混匀后经0.22 μm针式过滤器(1.1.7)过滤，待分析。
(2) 标准溶液衍生
取0.5 mL L-羟脯氨酸使用液(1.2.15)置于5 mL玻璃具塞刻度试管(1.1.6)中，加入0.5 mL Na2B4O7缓冲溶液(1.2.13)和0.5 mL衍生剂DNFB溶液(1.2.12)，具塞摇匀，于60 °C下避光反应1 h。反应完毕将试管置于冷水中冷却，用磷酸盐缓冲溶液(1.2.16)定容至5 mL，混匀后经0.22 μm针式过滤器(1.1.7)过滤，待分析。
2.3 色谱条件
2.3.1 异硫氰酸苯酯(PITC)衍生色谱条件
色谱柱： Vertex 色谱柱250mm×4.6mm×5μm
流动相A： 0.05mol/L乙酸钠水溶液（冰乙酸调节PH值为6.50±0.05）
流动相B: 甲醇：乙腈：水=20:60:20（V:V:V）
流速： 1.0 mL/min
检测波长： UV 254 nm
柱温： 45℃
进样体积： 10μL
梯度程序：
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时间/min
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0
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39
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40
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45
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46
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60
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流动相A/%
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95
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52
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0
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0
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95
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95
|
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流动相B/%
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5
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48
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100
|
100
|
5
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5
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2.3.2 2,4二硝基氟苯(DNFB)衍生色谱条件
色谱柱： Vertex 色谱柱
流动相A： 0.02mol/L Na2HPO4+ 0.02mol/L NaH2PO4水溶液
流动相B: 甲醇：乙腈=10:90（V:V）
流速： 1.0 mL/min
检测波长： UV 360 nm
柱温： 35℃
进样体积： 10μL
梯度程序：
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时间/min
|
0
|
35
|
42
|
50
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60
|
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流动相A/%
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86
|
60
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30
|
86
|
86
|
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流动相B/%
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14
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40
|
70
|
14
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14
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3 色谱图
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