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公司名称：
北京中西远大科技有限公司成都办事处
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参考价格：
未标明
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发布时间：
2012-07-24
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| 产品描述： |
| 银染法端粒酶活性检测试剂盒
一、原理
端粒DNA与细胞的寿命密切相关，而合成又依赖于端粒酶。正常人体细胞中不能检测出端粒酶活性的表达，而肿瘤细胞株及大多数肿瘤组织中的端粒酶活性却异常的高表达。因此对组织或细胞中端粒酶活性的检测具有重要意义。TRAP－银染法端粒酶活性检测试剂盒是采用端粒重复序列扩增的方法，利用银染技术检测端粒酶的活性。阳性结果在凝胶电泳上显示相隔6 bp的梯状条带，条带的深浅表示端粒酶活性的大小。TRAP-银染法保留了传统TRAP法灵敏度高、特异性强等优点，同时缩短了检测所需的时间，避免了同位素的放射污染。
三、操作步骤
1． 细胞端粒酶和组织标本端粒酶的提取
（1） 用PBS洗涤细胞二次（离心2000rpm，5min）收集1~2×106细胞；若是组织标本，称取0.5g左右的组织，用PBS洗涤后，研碎；
（2） 加入1ml冰冷的Wash buffer(使用前每ml Wash buffer中加入1μL 1M的DTT)，悬浮上述样品，置冰上5min；
（3） 4oC，离心 (3,000 rpm，5min)，弃上清；
（4） 加入40μL冰冷的Lysis buffer [使用前每ml Lysis buffer中加入0.5μL PMSF（100mM溶于异丙醇）和0.5μLβ-巯基乙醇（0.5M溶于水，一般市售纯液体为14.3M）]，悬浮沉淀，涡旋振荡10s，置冰上30min，其中间隔数分钟，涡旋振荡一次，共3-5次；
（5） 4oC，离心 (13,000 rpm，30min)；
（6） 把离心上清转移至新的管中，放置冰上并测定其蛋白浓度，最后用Lysis buffer调浓度至5～10μg/μL，于－20℃保存备用；
2． PCR扩增
（1） 吸取5μL 10×TRAP buffer，另加入1μL dNTPs，1μL Taq-DNA polymerase， 1 μL TS primer，2μL端粒酶提取物，然后加入39μL灭菌超纯水，于PCR扩增仪上23 oC保温10min；
（2） 加入1μL CX primer，混匀，在扩增仪上进行27个循环，循环参数94 oC，30s；50 oC，30s；72 oC，90s；最后72 oC延伸5min；
以下步骤的试剂需用户自备。
3． 聚丙烯酰胺凝胶电泳
（1） 制备12％非变性聚丙烯酰胺凝胶（10ml）
30％Acr－Bis（29：1） 4 ml
H2O 4.92 ml
10×TBE 1 ml
10％APS 70 μL
TEMED 10 μL
（2） 在电压180V，12％非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳预跑1hr；
（3） 取9μL PCR产物加上1μL 10×上样缓冲液，在电压180V，12％非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳1hr；
4． 银染
（1） 将凝胶置10％乙酸固定30min，然后用蒸馏水漂洗3次，每次5min；
（2） 将凝胶置于0.2 g/L硫代硫酸钠浸泡1min，然后用蒸馏水漂洗3次，每次30s；
（3） 将凝胶置于硝酸银染液浸泡30min，然后用蒸馏水漂洗15s；
（4） 将凝胶置于显色液中显色10min左右直到全部条带显色为止；
（5） 最后将凝胶置于10％乙酸浸泡5min终止反应。
四、储存
dNTPs、Taq-DNA polymerase、TS primer、CX primer－20 oC保存，其它试剂4 oC保存。
保质期：一年。
用户自备试剂配方：
10×TBE（pH=8.3） (100mL) 10×上样缓冲液(10mL)
10.8g Tris 25mg 溴酚兰
5.5g 硼酸 4g 蔗糖
4ml 0.5M EDTA 定容至10mL
定容至100mL
硝酸银染液(100mL) 显色液(100mL)
0.2g 硝酸银 3g 碳酸钠
25μL 37％甲醛 25μL 37％甲醛
定容至100mL 0.4mg 硫代硫酸钠
定容至100mL
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M313662 银染法端粒酶活性检测试剂盒 的详细介绍
银染法端粒酶活性检测试剂盒
一、原理
端粒DNA与细胞的寿命密切相关，而合成又依赖于端粒酶。正常人体细胞中不能检测出端粒酶活性的表达，而肿瘤细胞株及大多数肿瘤组织中的端粒酶活性却异常的高表达。因此对组织或细胞中端粒酶活性的检测具有重要意义。TRAP－银染法端粒酶活性检测试剂盒是采用端粒重复序列扩增的方法，利用银染技术检测端粒酶的活性。阳性结果在凝胶电泳上显示相隔6 bp的梯状条带，条带的深浅表示端粒酶活性的大小。TRAP-银染法保留了传统TRAP法灵敏度高、特异性强等优点，同时缩短了检测所需的时间，避免了同位素的放射污染。
三、操作步骤
1． 细胞端粒酶和组织标本端粒酶的提取
（1） 用PBS洗涤细胞二次（离心2000rpm，5min）收集1~2×106细胞；若是组织标本，称取0.5g左右的组织，用PBS洗涤后，研碎；
（2） 加入1ml冰冷的Wash buffer(使用前每ml Wash buffer中加入1μL 1M的DTT)，悬浮上述样品，置冰上5min；
（3） 4oC，离心 (3,000 rpm，5min)，弃上清；
（4） 加入40μL冰冷的Lysis buffer [使用前每ml Lysis buffer中加入0.5μL PMSF（100mM溶于异丙醇）和0.5μLβ-巯基乙醇（0.5M溶于水，一般市售纯液体为14.3M）]，悬浮沉淀，涡旋振荡10s，置冰上30min，其中间隔数分钟，涡旋振荡一次，共3-5次；
（5） 4oC，离心 (13,000 rpm，30min)；
（6） 把离心上清转移至新的管中，放置冰上并测定其蛋白浓度，最后用Lysis buffer调浓度至5～10μg/μL，于－20℃保存备用；
2． PCR扩增
（1） 吸取5μL 10×TRAP buffer，另加入1μL dNTPs，1μL Taq-DNA polymerase， 1 μL TS primer，2μL端粒酶提取物，然后加入39μL灭菌超纯水，于PCR扩增仪上23 oC保温10min；
（2） 加入1μL CX primer，混匀，在扩增仪上进行27个循环，循环参数94 oC，30s；50 oC，30s；72 oC，90s；最后72 oC延伸5min；
以下步骤的试剂需用户自备。
3． 聚丙烯酰胺凝胶电泳
（1） 制备12％非变性聚丙烯酰胺凝胶（10ml）
30％Acr－Bis（29：1） 4 ml
H2O 4.92 ml
10×TBE 1 ml
10％APS 70 μL
TEMED 10 μL
（2） 在电压180V，12％非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳预跑1hr；
（3） 取9μL PCR产物加上1μL 10×上样缓冲液，在电压180V，12％非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳1hr；
4． 银染
（1） 将凝胶置10％乙酸固定30min，然后用蒸馏水漂洗3次，每次5min；
（2） 将凝胶置于0.2 g/L硫代硫酸钠浸泡1min，然后用蒸馏水漂洗3次，每次30s；
（3） 将凝胶置于硝酸银染液浸泡30min，然后用蒸馏水漂洗15s；
（4） 将凝胶置于显色液中显色10min左右直到全部条带显色为止；
（5） 最后将凝胶置于10％乙酸浸泡5min终止反应。
四、储存
dNTPs、Taq-DNA polymerase、TS primer、CX primer－20 oC保存，其它试剂4 oC保存。
保质期：一年。
用户自备试剂配方：
10×TBE（pH=8.3） (100mL) 10×上样缓冲液(10mL)
10.8g Tris 25mg 溴酚兰
5.5g 硼酸 4g 蔗糖
4ml 0.5M EDTA 定容至10mL
定容至100mL
硝酸银染液(100mL) 显色液(100mL)
0.2g 硝酸银 3g 碳酸钠
25μL 37％甲醛 25μL 37％甲醛
定容至100mL 0.4mg 硫代硫酸钠
定容至100mL
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