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提 供 商：
上海同田生物技术有限公司-高速逆流色谱仪HSCCC
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资料大小：
132K
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发布时间：
2007-01-19
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浏览次数：
1185
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资料介绍
摘 要 本文介绍了高速逆流色谱技术的工作原理、特点，综述了近年来高速逆流色谱(HSCCC)在分离制备天然产物、蛋白质、抗生素、无机物等领域的进展，尤其是近几年在中药尤其是植物药有效成分分离纯化方面的应用情况，总结了适用于HSCCC的溶剂体系，并展望了HSCCC与质谱、蒸发光散射联用等新技术的应用前景。
摘 要 本文介绍了高速逆流色谱技术的工作原理、特点，综述了近年来高速逆流色谱(HSCCC)在分离制备天然产物、蛋白质、抗生素、无机物等领域的进展，尤其是近几年在中药尤其是植物药有效成分分离纯化方面的应用情况，总结了适用于HSCCC的溶剂体系，并展望了HSCCC与质谱、蒸发光散射联用等新技术的应用前景。
关键词 高速逆流色谱，溶剂选择，天然产物，抗生素，蛋白质，无机物，质谱，蒸发光散射
1 引 言
高速逆流色谱(high-speed countercurrent chromatography，简称HSCCC) 是一种较新型的液—液分配色谱,由美国国立健康研究院（National Institute of Health, U.S.A.）Ito博土最先研制开发，其原理是基于样品在旋转螺旋管内的互不混溶的两相溶剂间分配不同而获得分离，因而无须任何固体载体或支撑体，能达到在短时间内实现高效分离和制备，并且可以达到几千个理论塔板数。与其他柱色谱相比较，它克服了固定相载体带来的样品吸附、损失、污染和峰形施尾等缺点[3]。目前此项技术已被应用于生化、生物工程、医药、天然产物化学、有机合成、环境分析、食品、地质、材料等领域[5]。我国是继美国、日本之后最早开展逆流色谱应用的国家，俄罗斯、法国、英国、瑞士等国也都开展了此项研究。美国FDA及世界卫生组织（WHO）都引用此项技术作为抗生素成分的分离检定，90年代以来，高速逆流色谱被广泛地应用于天然药物成分的分离制备和分析检定中。本文对高速逆流色谱的原理特点及应用作一综述。
2 高速逆流色谱仪及溶剂体系简介
2.1 高速逆流色谱仪原理及特点
HSCCC利用了一种特殊的流体动力学(单向流体动力学平衡)现象。具体表现为一根100多米长的螺旋空管，注入互不相溶的两相溶剂中的一相作为固定相，然后作行星运动；同时不断注入另一相（流动相），由于行星运动产生的离心力场使得固定相保留在螺旋管内，流动相则不断穿透固定相；这样两相溶剂在螺旋管中实现高效的接触、混合、分配和传递。由于样品中各组分在两相中的分配比不同，因而能使样品中各组分得到分离。
2.2 HSCCC的优点
HSCCC主要具有以下几个方面的优点。
2.2.1 应用范围广，适应性好。由于溶剂系统的组成与配比可以是无限多的，因而从理论上讲HSCCC适用于任何极性范围的样品的分离， 所以在分离天然化合物方面具有其独到之处。并因不需固体载体，而消除了气液色谱中由于使用载体而带来的吸附现象，特别适用于分离极性物质和其它具有生物活性的物质。
2.2.2 操作简便，容易掌握。分离过程中对样品的前处理要求低，仅需一般的粗提物即可进行HSCCC的制备分离或分析。
2.2.3 回收率高。由于没有固体载体，不存在吸附、降解和污染，理论上样品的回收率可达100％。在实验中只要调整好分离条件，一般都有很高的回收率。
2.2.4 重现性好。如果样品不具有较强的表面活性作用，酸碱性也不强，那么多次进样，其分离过程稳定性都保持很好、峰的保留相对标准偏差也小于2%，重现性相当好。
2.2.5 分离效率高，分离量较大。由于其与一般色谱的分离方式不同，能实现梯度操作和反相操作、亦能进行重复进样，使其特别适用于制备性分离，产品纯度高。研究结果表明:一台普通的高速逆流色谱仪一次进样可达几十毫升，一次可分离近10g的样品。因此，在80年代后期被广泛地应用于植物化学成分的分离制备研究。
最初的高速逆流色谱仪只有一个分离柱，用配重平衡离心体系。最近的仪器在设计上有较大突破，采用多个分离柱，不用配重，性能和实用能力大大提高。目前高速逆流色谱仪有分析型和半制备、制备型三大系列，较大的制备型HSCCC，柱容积可达1000mL，一次最多进样可达20g粗品。不但适用于非极性化合物的分离，也适用于极性化合物的分离，对检测器的灵敏度要求不高。在制备分离方面，可用于天然产物中各组分的分离，也可进一步精制，甚至直接从粗提物一步纯化到纯品。
2.3 溶剂体系的选择
正确地选择溶剂体系是HSCCC分离成功的关键。通常所用的溶剂体系分为三类:亲水体系，由极性小的非水相与水相组成，两相极性相差很大；亲油体系，由高极性的非水相与水相组成，两相极性相差不大；还有一类处于两者之间，为中间体系。选择溶剂体系时遵循两个原则[6,9]：（1）溶剂体系的分层时间小于30S ；（2）目标样品的分配系数K接近于1，容量因子大于1.5。选择的方法有三种：参考前人体系、薄层色谱、高效液相。正己烷／乙酸乙酯／正丁醇／甲醇/水和氯仿／甲醇／水是比较经典的两个体系。对于未知样品混合物，推荐先采用正己烷／乙酸乙酯／甲醇/水(1∶1∶1∶1)或氯仿／甲醇/水(10∶3∶7)尝试，再根据目标组分的分配系数调整溶剂组成[9]。如可用乙醇代替甲醇增加体系的疏水性；加入盐(乙酸铵等)或酸(三氟乙酸或乙酸)增加体系亲水性。有文献报道：正丁醇／乙酸乙酯/水(3∶2∶5)适于分离极性大的物质，而正庚醇／乙酸乙酯／甲醇/水(6∶1∶6∶1)适于分离弱极性和非极性物质[10]。
近年来，溶剂体系的选择范围越来越广泛。有人用超临界二氧化碳(SFCO2)作流动相[11]，利用SFCO2高扩散性、低粘度、流体特性、环境友好等优势[12]。还有人用制冷剂R134a(1，1，1，2—tetrafluoroethane)作流动相。由于B134a这种流动相在常温常压下是气体，不必再富集或蒸干溶剂收集，从而避免了纯品的损失。有人提出当准确了解两相组成后，可以独立配制上下两相，避免溶剂的浪费[15]。
3 最新研究进展
3.1 天然产物
HSCCC使用的溶剂体系的组成是千变万化的，各溶剂的性质也各不相同，因而具有很强的适应性，为从复杂的天然产物中提取有效成分提供了有利条件。因此，国际上HSCCC被大量用于天然产物各类化学成分的分离纯化，如生物碱、黄酮类、萜类、木脂素、香豆素类等，以下为一些成功应用实例：
3.1.1 银杏 Gingkgo biloba 采用氯仿/甲醇/水（4:3:2）体系，可从银杏叶粗提物中一次分离得到白果内酯单体 [2]。此外利用HSCCC与HPLC相结合，以水为固定相，乙酸乙酯为流动相，梯度增加异丁醇，至乙酸乙酯与异丁醇之比为（6:4），可一次分离出7个黄酮苷，纯度达98%以上。
3.1.2 丹参 Salvia miltiorrhiza 使用三种溶剂系统，经HSCCC分极梯度洗脱，可从丹参粗提物中一次分离纯化得到丹参酮IIA(tonshinone II A ) ，丹参酮I（tanshinoneI），隐丹参酮(cryptotanshinone)[3]。
3.1.3 粉防己 Stephania tetrandra 粉防己主要含生物碱类。用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水（3:7:5:5）为溶剂系统，从粉防己干燥根提取物中分离了粉防己碱（tetrandrine）、去甲粉防己碱（fangchinoline）和轮环藤酚碱（cyclanoline）。
3.1.4 黄连 Cotis chinensis 主要含小檗碱等生物碱。利用制备型HSCCC从黄连根生物碱粗提物中分离纯化得到巴马亭（palmatine）、小檗碱（epiberberine）及黄连碱（coptisine）[4]。
3.1.5 虎杖 Polygonum cuspidatwn 含蒽醌类化合物等成分。分别用氯仿/甲醇/水（4:3:2）、乙酸乙酯/乙醇/水（10∶1∶10）溶剂体系，经MS与1HNMR鉴定，从虎杖根的乙酸乙酯提取物及水提物中分离得白藜芦醇（resveratrol）、虎杖甙（polydatin）单体 [5]。
3.1.6 葛 Pueraria lobata 用乙酸乙酯/正丁醇/水（2:1:3）溶剂系统，可从葛根粗提物中一步分离得到包括葛根素（puerarin）在内的七个异黄酮类化合物[6]。
3.1.7 苹果 Malus pumila 苹果皮含有色素类成分。以乙酸乙酯/水（1:1）为溶剂系统（上层为流动相），一次进样得到了聚合程度不同的原矢车菊素(procyanidin)；用正丁醇/乙酸乙酯/乙腈/0.1%三氟乙酸（2:4:3:8）溶剂系统细分得Procyanidin A及procyanidin B[7]。
3.1.8 牛膝 Achyranthes bidentata 多糖类为牛膝活性成分之一。以12.5% PEG1000及65%磷酸钾缓冲液组成的水性二相系统，在正交轴式HSCCC上，实现了牛膝多糖的分离和纯化[8]。
3.1.9 宽叶羌活 Notopterygium forbessi 以石油醚/乙酸乙酯/甲醇/水(比例从5:5:4.8:5至5:5:5:4)为溶剂系统，从中分离得到notopterol、isoimperatorin，纯度在98％以上[9]。
3.1.10 红豆杉 Taxus chinensis 红豆杉粗提物采用正己烷/乙酸乙酯/乙醇/水（2:5:2:5）及正己烷/氯仿/甲醇/水（5:25:34:20）为溶剂系统，分离纯化得到10-脱乙酰浆果紫杉素（10-deacelylbaccatin），纯度在98%以上[10]。此外，分别用正己烷/乙酸乙酯/乙醇/水（6:3:2:5）和正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水（1:1:1:1）为溶剂系统，从粗提物中分离纯化了三个结构相似的紫杉烷类二萜化合物质紫杉醇（taxel）、三尖杉宁碱（Cephalomannine）、浆果紫杉素（baccatin）。以石油醚（bp. 40～65ºC）/乙酸乙酯/甲醇/水（50:70:80:65）为两相体系，从紫杉醇的混合物中分离得到了纯的紫杉醇和三尖杉宁碱。
3.1.11 大黄 Rheum officinale 大黄含蒽醌类化合物，以氯仿/甲醇/水（6:3:2）为溶剂系统，从大黄根茎中分离出大黄素（aloe-emodin）、大黄酸（rhein）、大黄酚(chrysophanol)、和大黄素(cmodin)；用正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水（9:1:5:5）梯度洗脱，从掌叶大黄Rheun palmatum的根茎中也分离了大黄素甲醚、芦荟大黄酸、大黄酸、大黄酚和大黄素，纯度在98%以上[11]。
3.1.12 盐生肉苁蓉 Cistanche salsa 以乙酸乙酯/正丁醇/乙醇/水（4:0.6:0.6:5，v/v）为溶剂系统，从盐生肉苁蓉提取物中分离得到phenylethanoid glycosides(PhGs)、acteoside、2`-acetylacteoside，纯度在98%以上[12]。
3.1.13 山茱萸 Cornus officinalis 以乙酸乙酯/正丁醇/水(5:1.8:6)及乙酸乙酯/乙醇/水(5:0.5:6)，从1g山茱萸果实的正丁醇提取物中分离得到60mg没食子酸(gallic acid)，纯度为97％[13]。
3.1.14 积雪草 Centella asiatica 主要含多种α-香树脂醇型的三萜成分。以氯仿/甲醇/异丁醇/水(7:6:3:1)为溶剂系统，从积雪草的抽提物中分离纯化得到结构非常相似的两种成分，积雪草苷（asiaticoside）和羟基积雪草甙(madecassoside)，它们仅在同一支链上有差别，前者是H，后者是OH。
3.1.15 山楂 Crataegus pinnatifida从山楂叶粗提物中分离<
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