| 人褪黑素（MT）ELISA试剂盒使用说明书
本试剂盒仅供研究使用
最低检测限：12.5 ng/ml
特异性：本试剂盒可检测人MT，且与其他相关物质无交叉反应。
有效期：6个月
预期应用：ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中MT含量。
说明
1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。
2．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
3．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。
4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。
实验原理
本试剂盒采用酶联免疫直接竞争法检测MT。微孔板上包被有抗体MT抗体。加入MT标准品或样品，然后加入生物素标记的MT。样品中的MT、生物素标记MT与固相板上的抗MT抗体发生竞争结合。再向微孔中加
辣根过氧化物酶标记的亲和素，形成固相抗体-生物素化MT-亲和素-HRP复合物。经加底物显色后，随着样品中MT浓度的升高，显色OD值呈逐渐下降的线性关系。
试剂盒组成及试剂配制
1. 酶联板（Assay plate ）：一块（96孔）。
2. 标准品（Standard）：5×1ml/瓶。
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标准品
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S1
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S2
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S3
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S4
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S5
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浓度
（ng/ml）
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25
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50
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100
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200
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400
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3. 生物素标记MT：1×6ml/瓶。
4. 辣根过氧化物酶标记亲和素（HRP-Avidin ）：1×6ml/瓶。
5. 底物溶液A（Substrate A）：1×6ml/瓶。
6. 底物溶液B（Substrate B）：1×6ml/瓶。
7. 浓洗涤液（Wash Buffer）：1×15ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释20倍。
8. 终止液（Stop Solution）：1×6ml/瓶（2N H2SO4）。
需要而未提供的试剂和器材
1. 标准规格酶标仪
2. 高速离心机
3. 电热恒温培养箱
4. 超声清洗器
5. 干净的试管和Eppendof管
6. 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器
7. 蒸馏水，容量瓶等
标本的稀释原则：
首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准曲线的范围内，检测的结果才是准确的。稀释的过程中，应做好详细的记录。最后计算浓度时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以“N”。
浓洗涤液稀释原则：
临用前用蒸馏水进行20倍稀释。如有盐析出，稀释后水浴加温助溶。
操作步骤
实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，先进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。
1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔不加任何溶液，余孔分别加标准品或待测样品50ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，然后在所有孔中加入50 ul 生物素标记MT（空白孔中不加）。尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。酶标板加上盖或覆膜，37℃反应60分钟（为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液）。
2. 温育后，弃去孔内液体，甩干，洗板3-5次，每次浸泡10秒，约200ul/每孔，甩干。
3. 所有孔中加入50 ul辣根过氧化物酶标记亲和素。尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。酶标板加上盖或覆膜，37℃反应30分钟
4. 按步骤2进行洗涤。
5. 依序每孔加底物溶液A和B各50ul，37℃避光显色（30分钟内，一般10-15分钟内，此时肉眼可见标准品的后3-4孔有明显的梯度蓝色，前3-4孔颜色不明显，即可终止）。
6. 依序每孔加终止溶液50ul，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。
7. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。 在加终止液后15分钟以内进行检测。
注：
1. 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。
2. 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2N H2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。
3. 为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。
4. 未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8℃保存。
5. 建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
计算
以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
注意事项
1. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。
2. 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。
3. 一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
5. 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。
6. 底物请避光保存。
7. 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。
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