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大鼠睾酮（T）ELISA试剂盒使用说明书
本试剂盒仅供研究使用
检测范围： /ml25.6/ml
特异性：本试剂盒可同时检测天然或重组的睾酮，且与其他相关蛋白基本无交叉反应。
有效期：6个月（2-8℃避光保存）
预期应用：ELISA法定量测定大鼠血清，血浆及其它相关生物液体中睾酮含量。
说明
1. 浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
2. 刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。
实验原理
采用竞争酶联免疫法法检测睾酮含量。首先用一株单抗体包被微孔板，制备成固相抗体，然后加入待测标本及辣根过氧化物酶标记的另一株单抗，使之形成包被抗体-睾酮-酶标记抗体的复合物。经显色后在酶标仪测定吸光值（OD值），通过计算机或作图拟合浓度-吸光度曲线，反算出待测标本中睾酮含量。
试剂盒组成及试剂配制
1. 酶联板（Assay plate ）： 一块（96孔）。
2. 标准品（Standard）： 5瓶（冻干品）。
标准品为冻干品，使用前分别用0.5ml蒸馏水溶解，溶解后浓度分别为：
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Standard 1
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Standard 2
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Standard 3
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Standard 4
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Standard 5
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0.1ng/ml
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0.4ng/ml
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1.6ng/ml
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6.4ng/ml
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25.6ng/ml
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3. 酶结合物（HRP-conjugated antibody）： 1×6ml/瓶。
4. 显色剂A（Substrate A）： 1×7ml/瓶。
5. 显色剂B（Substrate B）： 1×7ml/瓶。
6. 浓洗涤液（Wash Buffer）： 1×15ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释20倍。
7. 终止液（Stop Solution）： 1×7ml/瓶
需要而未提供的试剂和器材
1. 标准规格酶标仪
2. 高速离心机
3. 电热恒温培养箱
4. 干净的试管和Eppendof管
5. 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器
6. 蒸馏水，容量瓶等
标本的采集及保存
1. 血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
2. 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
3. 细胞培养物上清或其它生物标本：1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
注：以上标本置4℃保存应小于1周，-20℃或-80℃均应密封保存，-20℃不应超过1个月，-80℃不应超过2个月；标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
操作步骤
1. 将各种试剂至室温〔18-25℃〕平衡半小时，取浓缩洗涤液，根据当批检测数量，用蒸馏水上1：20稀释，混匀后备用。
2. 标准品Standard 1- Standard 5，第一次使用前先用0.5ml蒸馏水溶解，放置混匀后使用。
3. 将酶标板取出，设一个空白对照孔、不加任何液体；每个标准点依次各设两孔，每孔加入相应标准品50ul；其余每个检测孔直接加待测标本50ul。
4. 每孔加入酶结合物50ul（空白对照孔除外），充分混匀，贴上不干胶封片，置37℃温育2小时。
5. 手工洗板，弃去孔内液体。洗涤液注满各孔，静置10秒甩干，重复三次后拍干；洗板机洗板，选择洗涤三次程序，洗板后拍干。
6. 每孔加显色剂A液50μl，显色剂B液50μl，振荡混匀后，37℃避光显色15分钟，每孔加终止液50μl。
7. 用酶标仪读数，取波长450nm，先用空白孔调零点，然后测定各孔OD值。
数据处理
1. 手工作图：用双对数坐标纸，以标准品浓度为横轴，以对应的0D值为纵轴，画出平滑曲线或直线，在曲线上按照待测血清OD值找到对应的浓度值。
2. 计算机：使用线性拟合功能，应将标准品S1-S5的浓度取对数（Log（浓度））作为X，将对应的OD值减去空白对照孔OD值后取对数（Log（OD值-NSB））作为Y，进行线性拟合。再从拟合线上计算出待测血清浓度。
注意事项
1. 从冷藏环境中取出的试剂盒内全部瓶装试剂及所需预包被板条应置室温
（18-25℃）平衡30分钟后方可使用，余者应及时封好口，放回2-8℃中避光保存，以备后用。
2. 使用前试剂应摇匀。
3. 结果判断须在反应终止后10分钟内完成。
4. 不同批号的试剂不可混用。
5. 加样时应注意避免所用各试剂及样品之间的交又污染。
6. 操作时，试剂盒内每种试剂各使用一个吸头，每一种标准品使用一个吸头，每一个样品各使用一个吸头，吸头最好一次性使用。
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