| CSA法和改进CSA法的敏感性和存在的问题
提高IHC敏感性有几种途径。一是依靠各种IHC的前处理，例如酶的消化、高温的抗原修复，虽然对其的基本原理不十分清楚，但却十分实用；其次是增加IHC方法的放大倍数，主要是酶结合量的增加。例如EnVison法，一个EnVision葡聚糖多聚物结合100个左右的酶分子和15个抗体分子，要比二步法S-P（LSAB）上结合的酶分子多许多倍。
虽然EnVision法的敏感性大大提高，方法也简便，但其大分子对于核内抗原的定位就不如LSAB法，存在穿透核膜困难的问题。因而，有时EnVision法就不如LSAB法敏感，尤其是活细胞核内抗原定位更为困难。CSA法的应用，既克服了LSAB法敏感性不高的缺点，又保留了较好的细胞穿透性。
已有的研究结果证实（Hasui K，2005；倪灿荣等，1999），CSA法较LSAB法敏感500—1000倍，较EnVision法敏感20～100倍。其对细胞周期素等核内抗原的定位，有独特的优点，定位准确性、敏感性、稳定性要较标准的CSA法好，其敏感性和穿透性要好于EnVision法。
最近，Hasui K等（2005）的研究结果表明，CSA法具有很高的敏感性的同时，也存在严重的内源性物质干扰（内源性生物素、内源性过氧化物酶、第一抗体与组织细胞内的不明物质的非特异性结合），尤其是经抗原热修复后情况更为严重。作者应用标准的EnVision法、CSA法和改进（加阻断剂）的CSA法检测淋巴结、正常肝、肝细胞癌、胃肠道鳞癌及癌周正常组织中k167抗原，其检测最佳效果的标准流程如下。
（1）4um石蜡切片常规脱蜡至水，PBS洗3x3min。
（2）首先用0．3％过氧化氢甲醇破坏内源性过氧化物酶的活性，室温20min。
（3）PBS洗3x3min。
（4）抗原修复，室温冷却20min。
（5）PBS洗3x3min。
（6）第二次用0．3％过氧化氢PBS破坏内源性过氧化物酶的活性，室温5min。
（7）用温的（35℃）TBST[0．02mol／L（pH7．8）Tris—HCl+NaCl+0．1％Tween20]洗3x3min。
（8）滴加蛋白阻断剂（0．25％酪蛋白），以阻断第一抗体的非特异性结合位点，10min，不洗。
（9）滴加适当稀释的第一抗体（在S-P法基础上5—10倍稀释），或4℃过夜。
（10）PBS洗3x3min，温的（35℃）TBST洗3x3min。37~C孵育15～60min，
（11）滴加蛋白阻断剂（0．25％酪蛋白），以阻断多聚物试剂的非特异性结合位点，lOmin，不洗。
（12）多聚物（EnVision）孵育15min，温热（35℃）TBST洗3x3min。
（13）滴加蛋白阻断剂（0．25％酪蛋白），以阻断CSA试剂的非特异性结合位点，10min，不洗；如用荧光素标记酪胺需用TBST洗3次。
（14）用生物素标记酪胺孵育15rain；如用荧光素标记酪胺孵育15～30rain。温热（35~C）TBST洗3X3min。
（15）链霉亲和素—HRP 37~C孵育15rain或HRP标记的抗FITC抗体孵育30rain，温的（35℃）TBST洗3X3min。
（16）0．04％DAB（含0．03％Hz02）显色5～10min。
（17）复染、脱水、常规树胶封固和结果观察。
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