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类固醇激素测定中的问题主要是密切相关的交叉反应物及血浆中结合蛋白的存在，尿液测定则新陈代谢产物是主要问题。最初，大多数类固醇激素是用以’H作标记物及用有机溶剂提取类固醇的放免方法测定，通常采用层析方法去除可能存在的交叉反应类固醇。
为校正预处理中的损失，提取前在样本中加入微量‘H标记的类固醇以估计提取回收率。这种方法通常非常准确，但由于操作步骤较多，精密度易受影响。目前，由于更为特异的抗血清和从结合蛋白中释放类固醇激素的封闭物质的发展，大多数类固醇激素测定方法已改为直接测定。
虽然这些方法减少了干扰，但并没有完全排除，因此，结合蛋白仍与分析物及竞争性标记物相互作用。为解决这些问题，可将纯的类固醇加入至已经炭吸附去除内源性类固醇的血清基质中制备标准晶，炭吸附处理也会去除可能会产生交叉反应或非特异干扰测定的小分子物质，因此，这样制备的标准品与临床样本并不一致，实际上，这意味着标准品的定值与类固醇的实际含量不一致。
在自动化免疫测定中，标记物通常为分子量较大的酶或荧光素，而不是放免中的小分子放射性核素，酶或荧光素标记的抗原反应速率与样本中的抗原是不一样的，温育时间短，则难于达到结合反应的平衡。因此，虽然直接的非放射性核素测定操作简单、测定精密度好，但准确度常容易出现问题。
可的松（cortis01）在血清和尿液中常以相对较高的浓度存在，虽然这可以使测定较为容易，但不同的试验得到的结果差异很大。一般来说血清可的松的测定较实际为高，最可能的原因是血清中可的松结合蛋白的干扰所致。试剂厂家使用各种封闭试剂将可的松从可的松结合球蛋白（CBG）中分离出来，但究竟使用的是什么封闭试剂及是否完全排除了结合蛋白的影响，厂家通常没有明确告知。尿液中含有大量的类固醇代谢物和干扰可的松测定的耦合物，因此，大多数试验要求在测定前必须将可的松提取出来，即使如此，也不能保证测定的准确度是可以接受的。有比较研究表明尿可的松免疫测定的值较实际值高2倍。
雌二醇（oestradi01）的测定在临床上有不同的目的，从而所要求测定方法的特性也有所不同。用于排卵诱导的监测则要求一个约为0．1～15nmol／L大的浓度测定范围，而且由于测定结果用来指导治疗时间是以天为基础的，因此，要求测定时间快速。故而雌二醇的测定几乎都用直接测定方法，普遍使用自动化分析仪。雌二醇测定在评价女孩子的青春期发育和绝经期妇女的卵巢功能中也很重要。在青春前期的女孩子中雌二醇水平低于大多数测定方法的测定下限，即20～30pmol／L，绝经期妇女雌二醇水平则低于100～llOpmol／L。某些直接测定方法宣称其测定下限可达上述测定范围，但这需用临床样本证实。
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